マウス骨髄細胞の単離　Fisher Scienceの資料

マウス骨髄細胞の単離

緒言

このプロトコルでは、骨髄からの細胞の単離について説明しています [1,2]。全血と比べて、骨髄は造血幹細胞（白血球、赤血球、血小板の産生に関与する）や内皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞、および脂肪細胞などの間質細胞を含むより複雑な細胞の組合せをもたらします。

材料

細胞培養皿（例：Thermo Scientific Nunc EasYDish Dishes, 100 mm、カタログ番号150466）
ラボワイプ（例：Fisher Scientific Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers1, -PlyFisher、Fisher Scientificカタログ番号06-666）
エタノール（例：Absolute Ethanol, 200 Proof, Molecular Biology Grade、カタログ番号T038181000CS）
RPMI完全培地
- RPMI1640培地（例：Gibco BenchStable RPMI 1640、カタログ番号A4192301）
- 2 mM L-グルタミン（例：Gibco L-Glutamine, 200 mM、カタログ番号25030149）
- ウシ胎児血清（例：Gibco Fetal Bovine Serum、カタログ番号26140087）
- オプション：ペニシリン-ストレプトマイシン（例：Gibco Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)、カタログ番号15070063、またはGibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)、カタログ番号15140122）
外科用メスとブレード
5～10 mLシリンジ（例：Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, 10 mL、カタログ番号14-955-459）
25ゲージ針（例：Fisher Scientific BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles、カタログ番号14-826-49）
70 μm細胞ろ過器（ストレーナー）（例：Fisherbrand Sterile Cell Strainers、カタログ番号22-363-548）
50 mLコニカルチューブ（例：Thermo Scientific Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes、カタログ番号339652）
赤血球（RBC）溶解バッファー（例：Invitrogen eBioscience 1X RBC Lysis Buffer、カタログ番号00-4333-57またはInvitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)、カタログ番号00-4300-54）
細胞カウンター（例：Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter、カタログ番号AMQAX2000）
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（例：Gibco PBS (10X), pH 7.4、カタログ番号70011069）

手順

細胞の単離

無菌条件下で、マウスから骨髄大腿骨を分離し、無菌細胞培養皿の中に置きます。

ピンセットと小さいはさみを使用して、骨から筋肉と線維組織を切り離します。筋肉がまだ無処理のままである場合は、70%エタノールで飽和させたキムワイプで骨を拭いて余分な筋肉繊維を除去します。

5～7 mLのRPMI完全培地を新しい滅菌細胞培養皿に加えます。RPMI 1640培地にウシ胎児血清を添加して、最終濃度10%、2 mM L-グルタミン（現在GlutaMAXが添加されていない培地を使用している場合）にすることで、完全なRPMI 1640培地を調製します。オプション：培地に1%ペニシリン-ストレプトマイシン（5,000ユニット／mL）を添加します。

外科用メスまたは鋭利なはさみで大腿骨の両端を切断して、両端をきれいにします。

25ゲージ針を10 mLシリンジに取り付けます。5 mLのRPMI完全培地をシリンジの中に吸い上げます。

ピンセットを用いて、5～7 mLのRPMI完全培地を含む細胞培養皿の上に骨を保持し、5 mLのRPMI完全培地を含むシリンジを使用して骨髄を細胞培養皿の中に注意深く洗い流します。必要に応じて、骨が白くなるまで洗い流し（フラッシング）を繰り返します。骨が白くなるのは、すべての骨髄が除去されるからです。すべての骨に対してこのステップを繰り返します。

70 μm細胞ろ過器を新しい50 mLコニカルチューブの上に置き、チューブラックの中に直立させます。

滅菌血清ピペットを使用して、すべての骨髄を細胞培養皿からろ過器の中に移します。RPMI完全培地を細胞培養皿に加え、残った骨髄をろ過器に移し続けます。

10 mLシリンジのプランジャーのみを使用して（プランジャーの黒いゴムの端に触れないで、無菌状態を維持してください）、70 μm細胞ろ過器に含まれる骨髄を下向きに円を描くようにつぶします。大きな骨髄片が残存していないことを確認します。

プランジャーの端から残った骨髄を、RPMI完全培地でろ過器の中に洗い流し、できるだけ多くの細胞を回収します。

ろ過器を5～7 mL RPMI完全培地ですすぎます。ろ過器を取り外し、サンプルの入っているコニカルチューブに蓋をします。

細胞を600 x gで4分間4℃で遠心分離し、上清を廃棄します。

細胞ペレットに約5 mLのRPMI完全培地を加え、上下にピペッティングして再懸濁します。

チューブラックの中に立てた新しい50 mLコニカルチューブの上に、新しい70 μm細胞ろ過器を置きます。

再懸濁した骨髄サンプルを細胞ろ過器でろ過してコニカルチューブに移します。必要に応じて生細胞を計数します。

細胞サンプルを適切な培地で再懸濁し、目的の細胞濃度にします。

プロトコルのコツ：

さらなる細胞のため、大腿骨を洗浄した後に乳鉢と乳棒で粉砕する場合があります。骨髄は、骨盤や脛骨を粉砕して単離することもできます。

細胞カウント

少量の赤血球サンプルをRBC溶解バッファーに溶解することで、免疫細胞を簡単に計数できます。1 mLの1倍RBC溶解バッファーを100 μLのサンプルに加えます。

時々振とうまたは回転させて、室温で4～5分間インキュベートします。

2～3 mLの1倍PBSを加えて反応を停止させます。

細胞を600 x gで4分間4℃で遠心沈殿させ、上清を廃棄します。

ペレットに約500 μLの完全RPMIを加え、上下にピペッティングしてペレットを破壊します。

血球計算盤またはInvitrogen Countess 3 Automated Cell Counter（自動細胞カウンター）を用いて生細胞を計数します。

オプション：

Invitrogen MagniSort Kitまたは Invitrogen Dynabead Kitを使用した免疫細胞単離プロトコル、または細胞刺激プロトコルに進みます。

参照

Madaan A, Verma R, Singh AT et al.(2014) A stepwise procedure for isolation of murine bone marrow and generation of dendritic cells. J Biol Methods 1(1):e1.
Liu X, Quan N (2015) Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio Protoc 5(20):e1631.PMID 27441207.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.